山羊神经干细胞的分离培养及体外诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3691-3695.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.014

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

山羊神经干细胞的分离培养及体外诱导分化

夏许可，张伟，余杰锋，章莹

¹解放军广州军区广州总医院骨科医院，广东省广州市 510010；²南方医科大学研究生院广东省广州市 510515；³广东冠昊生物科技股份有限公司，广东省广州市 510530；⁴广州医科大学研究生院，广东省广州市 510182

修回日期:2014-04-17 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
通讯作者: 章莹，博士，主任医师，解放军广州军区广州总医院骨科医院，广东省广州市 510010
作者简介:夏许可，男，1987年生，北京市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事外周神经损伤的研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2010B031100017)；广州市科技计划项目(2012J4100039)

In vitro culture and differentiationof goat neural stem cells

Xia Xu-ke^{1, 2}, Zhang Wei³, Yu Jie-feng^{1, 4}, Zhang Ying¹

¹Department of Orthopedics, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China; ²Graduate School of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; ³Grandhope Biotech Co., Ltd., Guangzhou 510530, Guangdong Province, China; ⁴Graduate School of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China

Revised:2014-04-17 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
Contact: Zhang Ying, M.D., Chief physician, Department of Orthopedics, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China
About author:Xia Xu-ke, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China; Graduate School of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
the Key Science and Technology Program of Guangdong Province, No.2010B031100017; the Key Science and Technology Program of Guangzhou City, No.2012J4100039

摘要/Abstract

摘要：

背景：文献报道不同种类的神经调控因子及神经胶质细胞对神经干细胞分化成熟具有不同的作用，但大动物的神经干细胞培养报道则相对较少。

目的：探究山羊神经干细胞的培养条件及体外诱导分化结果。

方法：取幼羊脑组织分离神经干细胞后于神经干细胞全培养液中悬浮培养，后期行抗-巢蛋白一抗免疫组织化学染色鉴定，同时取坐骨神经分离培养许旺细胞；以血清诱导干细胞体外诱导分化后行抗-S100一抗、抗-胶质纤维酸性蛋白一抗、抗-MAP2一抗染色分别标记许旺细胞及神经胶质细胞，以未添加一抗做对照，计算图像灰度值与对照组进行统计学比较。

结果与结论：成功分离培养抗-巢蛋白染色阳性神经球及抗-S100染色阳性许旺细胞，后期神经干细胞体外诱导分化得抗-胶质纤维酸性蛋白、抗-MAP2染色阳性细胞，其免疫组织化学染色灰度值显著高于对照组；分化产物抗-S100染色为阴性，其免疫组织化学染色灰度值显著低于对照组。结果表明山羊神经干细胞可经体外诱导分化为神经元及星形胶质细胞，未发现神经干细胞诱导分化为许旺细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 神经干细胞, 干细胞培养, 体外诱导分化}, 免疫组织化学, 山羊

Abstract:

BACKGROUND: Different types of nerve regulatory factors and glial cells have been reported to exert different roles in the differentiation and maturation of neural stem cells, but culturing neural stem cells in large animals is relatively rarely reported.

OBJECTIVE: To explore the way for culturing goat neural stem cells and to detect the outcome after in vitro differentiation.

METHODS: The neural stem cell was separated and cultured from the newborn goat cerebral cortex and the anti-nestin immunocytochemical staining was performed for cell identification. At the same time, anti-S100 active Schwann cells were gotten from the sciatic nerve. Then in vitro differentiation was preformed and the outcome was detected by the immunocytochemical stain of anti-glial fibrillary acidic protein, anti-microtubule-associated protein 2 and anti-S100. Cells without primary antibodies served as controls. Gray values were calculated and compared.

RESULTS AND CONCLUSION: The Schwann cells were cultured successfully, which were active to the anti-nestin immunocytochemical staining and anti-S100 staining. After differentiation, the products were active to anti-glial fibrillary acidic protein and anti-microtubule-associated protein 2 immunocytochemical stain, but

negative to the anti-S100. And significant difference was found in gray values. The goat neural stem cells and Schwann cells were successfully cultured and identified. After the differentiation, the astrocytes and neurons were detected, but the Schwann cells were not found.

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Key words: stem cells, neural stem cells, cells, cultured, goats

中图分类号:

R394.2

夏许可，张伟，余杰锋，章莹. 山羊神经干细胞的分离培养及体外诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3691-3695.

Xia Xu-ke1, 2, Zhang Wei3, Yu Jie-feng1, 4, Zhang Ying1. In vitro culture and differentiationof goat neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3691-3695.

图/表（结果） 2

2.1 神经干细胞培养及抗-巢蛋白免疫组织化学鉴定 细胞悬液培养5 d后于倒置相差显微镜下观察，可见强折光性神经球悬浮生长于培养液内，边界清晰，由2-4个细胞组成，并可见少量组织碎块及部分死细胞漂浮于培养液中，肉眼观培养液呈橙黄色，微浊。换液2次后组织碎块及死细胞数量减少，神经球明显增大(图1A)。传代后再次于镜下观察，可见细胞团呈强折光性，直径较前减小。第3代神经球表达神经干细胞特异性巢蛋白，行抗-巢蛋白免疫组织化学检测呈阳性反应(图1B)。

2.2 许旺细胞纯化培养及抗-S100免疫组织化学鉴定 组织块接种培养三四天后培养液呈淡黄色，可见大量坏死组织块漂浮于液面，此时倾出培养液及坏死组织，可见少量组织块贴附于培养瓶内，镜下观察可见自附壁组织块周缘爬行生长出条索状细胞若干，细胞两端尖细，中部膨隆，可见胞核。细胞自附壁组织块周缘向外呈放射性生长。另可见培养瓶内散在分布不规则形状细胞，包体不规则向外突起，核大，居中。传代培养并利用前述差速贴壁法纯化后可见瓶内均匀分布大量条索状细胞，细胞排列较紧密，具有“肩并肩、手拉手”样特征。抗-S100免疫荧光染色后于荧光显微镜下可见细胞核及胞体发出黄绿色荧光(图1C)。

2.3 神经干细胞诱导分化及抗-胶质纤维酸性蛋白/抗- S100/抗-MAP2免疫组织化学鉴定 以诱导分化培养液培养7 d后于倒置相差显微镜下观察，可见大量神经球贴壁，自外周发出突触若干，突触细长，具有分支。部分细胞形态改变，胞体变大，呈圆形或多角形，并向四周发出突触。抗-胶质纤维酸性蛋白及抗-MAP2免疫荧光检测见大量细胞核、包体及突触发出绿色荧光(图2A，B)，DAPI复染后可见胞核发出蓝色荧光(图2C)，抗-S100免疫荧光未检见阳性产物。

2.4 图像灰度量化及统计学比较结果 按前所述以ImageJ1.47图像分析软件测量各组图像灰度值，并以SPSS13.0统计分析软件对结果进行统计学比较(表1)。结果显示，经神经干细胞体外分化后的细胞抗-巢蛋白、抗-MAP2、抗胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色各阳性组与对应阴性对照组灰度值均数比较差异均有显著性意义(P < 0.001)；分化后细胞行抗-S100免疫组织化学染色阴性组与阳性对照组(许旺细胞进行抗-S100免疫组织化学染色)灰度值均数进行比较差异有显著性意义(P < 0.001)。

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引言

神经干细胞具有较强的增殖分裂与自我更新能力、多向分化潜能、弱免疫原性及较强的迁徙能力^[1]，可根据自身遗传物质及外周环境调控分化为具有特定功能的前体细胞。目前已知神经干细胞接触血清后贴壁并分化^[2]，与中枢、外周神经损伤后病程发展及预后联系密切，在中枢及外周神经损伤中添加自体或同种异体神经干细胞可促进损伤部位修复，提高治疗效果。在早期临床移植研究中，神经干细胞主要应用于中枢神经系统损伤的辅助治疗，临床以神经干细胞移植辅助治疗脊髓损伤及脑卒中等中枢系统疾病并取得了满意疗效^[3]。同时，近年研究表明，于外周神经缺损的导管修复中添加神经干细胞，可加速神经断端吻合，增强修复后神经的传导质量，提高修复效果^[4]。有文献报道在外周神经缺损的修复中添加神经干细胞可以促进神经断端吻合及后期功能恢复，起到良好的修复效果^[5]。目前已有诸多文献报道神经干细胞分离培养技巧，亦有文献报道不同种类的神经调控因子及神经胶质细胞对神经干细胞分化成熟具有不同的作用^[6]，但相关研究多取材于鼠，而相关大动物的神经干细胞培养报道则相对较少。同时，中枢及外周神经系统具有不同的神经胶质细胞，目前已知于损伤部位添加神经干细胞对中枢及外周神经损伤皆具有修复作用，但移植后其分化、转归过程尚不明确。实验以初生山羊脑组织为材料成功分离培养山羊神经干细胞，并模拟体内血清环境对神经干细胞进行诱导分化，应用免疫组织化学方法检测分化产物，明确神经干细胞诱导分化转归过程，对临床进行神经干细胞移植治疗具有一定的提示意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：神经干细胞体外诱导分化实验。

时间及地点：实验于2013年3月至2014年1月在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。

材料：

实验动物：雄性1日龄初生山羊1只，体质量0.8 kg，由解放军广州军区广州总医院动物实验中心提供。

神经干细胞全培养液及诱导分化培养液的配制：①神经干细胞全培养液：取DMEM-F12培养基97 mL、N2添加剂 1 mL、B27添加剂2 mL配制成100 mL培养液，加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子各1.6 μg配制成神经干细胞全培养液，其中碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子浓度均为16 μg/L，B27体积分数2%，N2体积分数1%。②诱导分化培养液：取DMEM-F12培养基77 mL、胎牛血清 20 mL、N2添加剂1 mL、B27添加剂2 mL配制成诱导分化培养液，其中含体积分数胎牛血清20%、N2添加剂1%、B27添加剂2%，不含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子。③许旺细胞培养液：取DMEM培养基85 mL、胎牛血清15 mL配置成许旺细胞培养液，其中含体积分数胎牛血清15%。

实验方法：

山羊神经干细胞分离培养：初生山羊以咪达唑仑注射液(2 mL∶2 mg)0.5 mL肌注麻醉后取俯卧位，颅顶备皮并固定头部，碘伏消毒术野后铺巾。于颅顶自腹侧至背侧沿矢状面做长约8 cm纵行线性切口，分离皮下筋膜，暴露颅骨，开4 cm×4 cm骨窗后切断延髓，将全脑完整取出。取皮层灰质、海马组织块若干，大小约1.5 cm³，浸泡于4 ℃预冷PBS中待用。将组织块剥离软脑膜及血管后以无菌眼科剪持续剪碎约5 min至糊状匀浆，其间滴加少量4 ℃预冷神经干细胞全培养液，匀浆以加样枪进一步反复吹打，并加入神经干细胞全培养液2 mL后组织悬液过200目滤网，再次以神经干细胞全培养液1 mL冲洗滤网后收集过滤细胞悬液，调整细胞浓度至1×10¹⁰ L^-¹并接种于25 mL细胞培养瓶中，以1∶100比例添加双抗后放置于37 ℃、体积分数5%CO₂ 100%湿度细胞培养箱中培养。前述细胞悬液培养5 d后全部转移至离心管内低速离心，弃上清并以新鲜神经干细胞全培养液重悬沉淀细胞，即完成1次换液，间隔两三日再次行离心换液。待两三次换液后细胞团块增大，团块中央养分渗透减弱，细胞获取养分减少，此时行传代处理。以前述方法离心细胞悬液并以新鲜神经干细胞全培养液重悬细胞后将细胞悬液分装于2个新培养瓶中，以加样枪反复吹打细胞悬液以分散细胞团块，调整细胞浓度后放置于培养箱内继续培养。

山羊许旺细胞分离培养：前述山羊股外侧备皮、消毒、铺巾，沿髋-膝关节连线切开皮肤，逐层分离股外侧肌群，游离并暴露坐骨神经，切取2 cm神经束，浸泡于4 ℃预冷PBS中待用。剥离神经外膜并以无菌组织剪持续剪碎约 5 min至匀浆状，其间滴加少量4 ℃预冷许旺细胞培养液混匀，后加入3 mL许旺细胞培养液稀释后将组织匀浆直接接种于25 mL培养瓶中，以1∶100比例添加双抗后放置于 37 ℃、体积分数5%CO₂ 100%湿度细胞培养箱中，培养三四天后倾出培养液及坏死组织块，4 ℃预冷PBS漂洗培养瓶内铁壁组织块并加入3 mL许旺细胞培养液，置于培养箱中继续培养1 d后以0.25%胰酶消化，传代培养，可得许旺细胞。培养2 d换液，继续培养2 d后传代，并将消化后所得细胞悬液接种于培养瓶置培养箱内静置1 h，待成纤维细胞贴壁后将细胞悬液移入一新培养瓶内，并置于培养箱内培养三四天，反复此过程两三次可得纯净许旺细胞。

以如下步骤行免疫组织化学检测：4 ℃预冷体积分数4%甲醛溶液室温固定30 min、0.25%Triton X-100室温浸泡10 min、体积分数10%胎牛血清室温封闭30 min，甩除胎牛血清后直接加入1∶100比例一抗4 ℃过夜，隔日以PBS润洗后加入1∶100比例FITC标记二抗37 ℃避光孵育30 min，DAPI染核后甘油封固并于荧光显微镜下观察拍照。

神经干细胞抗-巢蛋白免疫组织化学鉴定：六孔培养板内置入灭菌洁净盖玻片，以500 mg/L多聚赖氨酸室温浸泡过夜，次日以三蒸水清洗3次并烘干后移入前述细胞悬液制作爬片。培养1周后添加少量胎牛血清促进贴壁12 h，PBS洗涤各孔，后以4 ℃预冷体积分数4%甲醛溶液室温固定 30 min、体积分数3%过氧化氢溶液室温浸泡10 min、 0.01 mol/L枸橼酸溶液并于95 ℃湿蒸10 min、体积分数10%胎牛血清室温封闭10 min、抗-巢蛋白一抗(1∶100) 4 ℃过夜、生物素化羊抗鼠二抗(1∶100)37 ℃孵育30 min、链霉卵白素-辣根过氧化物酶复合体室温浸泡40 min、DAB显色并于镜下观察拍照。以ImageJ1.47图像处理软件计算阳性孔及阴性对照孔平均灰度值，结果进行统计学分析。

山羊神经干细胞体外分化实验：山羊神经干细胞离心换液并以前述诱导分化培养液培养，间隔4 d后再次换液并继续培养3 d，并按前述免疫荧光步骤进行染片后以甘油封固并于荧光显微镜下观察并以ImageJ1.47软件进行图像分析。

主要观察指标：①神经干细胞培养及抗-巢蛋白免疫组织化学鉴定结果。②许旺细胞纯化培养及抗-S100免疫组织化学鉴定结果。③神经干细胞诱导分化及抗-胶质纤维酸性蛋白/抗-S100/抗-MAP2免疫组织化学鉴定结果。

图像量化及数据分析：抗-巢蛋白、抗-MAP2以及抗-胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色设阳性组与阴性对照组(未添加一抗)，各组分别取3个高倍视野(视野1，2，3)进行拍照，阳性组每张照片取2个阳性点(点A、B)以ImageJ1.47图像分析软件计算灰度，阴性组每张照片取间隔较远的随机2点计算灰度，2组灰度值均数进行两独立样本t 检验；抗-S100免疫组织化学染色设阴性组与阳性对照组(以许旺细胞进行染色)，各组灰度计算及统计学比较方法同前所述。

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讨论

神经干细胞是一类存在于神经系统中的未分化细胞，具有较强的自我更新能力，并能够通过非对称分裂方式产生新的细胞^[7]。目前以悬浮培养中枢神经干细胞较为常见，原代培养多取材于鼠类胚胎脑组织。本实验中脑组织取材于初生山羊，较以往取材于胚鼠培养成的神经干细胞而言^[8]，培养周期更长，且连续传代四五次后即出现分裂停止、细胞凋亡的情况，这与胚胎和成体间细胞活性的差异不无关系。同时，动物种类的不同也导致了组织活性存在一定差异。研究表明，小鼠外周神经缺损修复周期约为4周^[9]，猪等大动物则须4个月甚至更长时间^[10]，而临床中外周神经损伤修复周期一般大于6个月^[11]。由此可以看出，不同种类动物神经干细胞的培养条件基本相同，但培养周期具有一定差异。

神经干细胞培养及体外诱导分化受多种因素调节，过程较为复杂^[12-13]。表皮生长因子及成纤维细胞生长因子均具有促进细胞分裂、抑制分化的作用^[14]，二者共同作用可形成正反馈，显著提升生物学效应^[15]。

本实验以DMEM-F12培养液为基础，添加N2、B27等营养物质，同时加入维持细胞增殖、抑制分化的表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等辅助因子配制山羊神经干细胞全培养液，利用上述两因子的协同作用维持干细胞的增殖状态。

神经干细胞属悬浮生长细胞，生长于细胞团中心部位的神经干细胞主要通过培养液渗透方式获取营养物质，在重力的作用下易造成细胞团堆积而导致分布不均，且不存在细胞间的接触抑制，易因密度过大而造成细胞缺氧，故培养过程中对密度的调节较为重要。此外，当神经球直径增加时，培养液内营养物质渗透进入细胞团中心部位的能力减弱，故培养过程中适时对神经球进行吹打分散直接影响培养效果。

神经外膜下包含大量成纤维细胞，常规取材后需剥离神经外膜，可去除大量成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞会与许旺细胞接种并共同生长，造成许旺细胞纯度降低。本实验选取差速贴壁法对山羊许旺细胞进行分离纯化，不添加抑制细胞生长的化学物质，不损伤目的细胞，取得了良好的效果。神经干细胞不但具有独特的神经球样外观，而且表达巢蛋白。这是一种中间丝类型的蛋白，表达于胚胎发育早期的神经上皮，是神经干细胞的特异性标志物^[16]。在相当长的一段时期内，巢蛋白曾被认为是神经干细胞独有的特异性标志物，但随着研究的深入，科研人员发现某些肿瘤细胞亦表达此类蛋白^[17]。目前，抗-巢蛋白染色仍为神经干细胞鉴定的主要检测手段。

本实验原代培养取材于健康山羊脑皮层及海马，细胞抗-巢蛋白免疫组织化学染色结果呈阳性，结合细胞悬浮生长的标志性神经球样外观，以及后期诱导分化所得产物，提示前期培养所得为神经干细胞。

中枢及外周神经系统发生损伤后，神经干细胞接受损伤因子的刺激迁移至损伤部位，在体内血清及其他神经、体液因子的诱导作用下发生分化，分泌神经活性物质并参与损伤修复^[18-19]。同时，损伤可激活休眠的内源性神经干细胞，与外源性神经干细胞共同参与损伤修复。

在中枢神经系统损伤修复中添加神经干细胞，干细胞迁移到损伤部位并于血清及神经、体液因子调解下分化为星形胶质细胞及神经元。在神经系统损伤因子的刺激下，星形胶质细胞体积增大、数量增多，于损伤部位分泌各类神经营养因子，参与重建损伤部位血-脑屏障结构，对损伤部位神经元的修复及再生具有重要的营养与支持作用，重新构建并维持受损区域内环境的稳态，为神经元再生创造条件。同时，部分干细胞分化为新生神经元并与损伤区域周围的神经元创建联系，重建损伤区域神经传导功能。在外周神经缺损导管修复中添加神经干细胞，干细胞分化为星形胶质细胞并维持导管内环境的稳态，分泌神经活性物质促进神经断端再生，从而减弱神经断端自身炎症反应，加速修复过程。

作为周围神经系统特有的胶质细胞，许旺细胞包绕轴突形成髓鞘，同时分泌神经生长因子、表皮生长因子等多种神经活性物质，在外周神经发育过程中起到重要作用。当外周神经损伤后，许旺细胞发生瓦勒氏变性，形成Bungner带并协同巨噬细胞吞噬髓鞘崩解产物。

目前尚无研究显示许旺细胞可由中枢神经干细胞体外分化得到，同时，神经干细胞与许旺细胞体外共培养，可促进神经干细胞贴壁分化，效果优于单纯培养神经干细胞^[20]。故此，于外周神经缺损导管修复中，复合添加神经干细胞及许旺细胞，不仅可以发挥许旺细胞的诸多生物学功能，同时还可以促进神经干细胞分化为星形胶质细胞，共同参与神经断端的吻合修复，提高修复效果。

山羊神经干细胞的分离培养及体外诱导分化

In vitro culture and differentiationof goat neural stem cells

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